Zum Nachlesen: das Abstract des Vortrages von Dr. Martin Schönfelder zum aktuellen WADA-Forschungprojekt.
Transkriptionsprofile im Kontext mit Testosteron und Bewegung in peripheren mononukleären Blutzellen
Fragestellung: Nach heutigem Wissenstand resultiert aus der Einnahme leistungsfördernder Substanzen in der Regel eine gewebespezifische Modulation der Genexpression. Aus diesem Grund liegt es nahe, alternative Techniken wie die realtime-PCR und Genarrays als mögliche Methoden in der Dopinganalytik zu etablieren und ihr mögliches Potential für die Praxis zu prüfen. Der Hauptfokus der laufenden Studie bezieht sich auf folgende Fragestellungen:
- Eignen sich spezifische hormon- und/oder belastungsinduzierte mRNA
Genexpressionsmuster in Blutzellen zur Dopinganalytik? - Eignet sich ein custom-made Genarray als mögliches Instrumentarium in der Dopinganalytik?
Material und Methodik: Im Rahmen der Studie wurden 19 freiwillige männliche Probanden untersucht. In der ersten Phase zur Validierung möglicher Belastungseffekte auf eine Genexpression in Blutzellen absolvierte eine Kontrollgruppe eine standardisierte Fahrradergometer-Belastung. Hierbei wurden vor und unmittelbar nach der Belastung Blut- und Urinproben gewonnen. Die zweiten Phase absolvierte eine weitere Probandengruppe unter kontrollierten und standardisierten Belastungsbedingungen in Kombination mit einer transdermalen Testosteron-Behandlung (1,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht). Zum Ausschluss möglicher circadianer Einflüsse wurden alle Blut-, Urin- und Speichelabgaben mit einer zeit-synchronen Kontrolle verglichen. Zur Dokumentation einer erfolgreichen Testosteron- Behandlung kamen der klassische T/E Assay aus Urin und eine Alternativbestimmung aus Speichel mittels ELISA zum Einsatz. Aus allen Blutproben wurde die Gesamt-RNA routinemäßig mit PaxGene Blood isoliert und mittels quantitativer Onestep-RT-PCR analysiert. Die Genarray-Analytik erfolgte durch einen custom-made Genarray, welcher auf Basis von Vorversuchen aufgesetzt wurde (Schönfelder et al. 2009).
Ergebnisse: Die Hormonanalysen zeigen eine Erhöhung der Testosteronspiegel sowohl in den Speichel- als auch den Urinproben. Dies indiziert, dass die transdermale Testosteron-Applikation erfolgreich war und in wenigen Stunden ihre Maximalwerte erreicht. Erste methodische Auswertungen der Reproduzierbarkeit von Genarray-Analysen aus Blutzellen belegen anhand von Referenz-RNA-Proben eine deutliche Abnahme der Analyse-Qualität der Arrays noch innerhalb des Haltbarkeitszeitraumes. Parallel durchgefü̈hrte PCR-Analysen zeigen, dass sowohl klassische Housekeeping-Gene als auch potentielle Zielgene unter dem Einfluss von Zeit, Belastung, Hormonbehandlung oder auch einer Kombination aus den Faktoren stehen. Lediglich zwei von neun getesteten Housekeeping-Genen (Cyclophilin B, beta-Actin) deuten auf eine Unabhängigkeit von den genannten Faktoren hin. Von bisher 13 potentiellen Zielgenen sind fünf nicht signifikant reguliert, u.a. der Androgen Rezeptor. Lediglich Interleukin-6 zeigt eine mögliche hormonelle Abhängigkeit, alle anderen Gene sind abhängig von einem oder mehrerer der genannten Variablen.
Diskussion/Zusammenfassung: Die ersten Ergebnisse zeigen auf, dass die Genarray-Analytik derzeit noch nicht auf dem erforderlichen Qualitätsstand ist, um über längere Zeit hinweg eine gleichbleibende Reproduzierbarkeit zu garantieren, insbesondere bei Batchwechseln. Die realtime RT-PCR zeigt eine hohe Reproduzierbarkeit. Hierbei unterliegen die Ergebnisse aber einer hohen
biologischen Varianz in Bezug auf Belastung, Zeit und Hormonsubstitution. Mit Hilfe ausgedehnter Clusteranalysen sollen weitere Zielgene eruiert und mittels RT-PCR validiert werden. Darüber hinaus zeigten die Hormonanalysen aus dem Speichel eine potentielle Methode eines direkten Nachweisverfahrens auf.
Acknowledgement: Bundesinstitut für Sportwissenschaft, World Anti Doping Agency, Institut für Dopinganalytik und Sportbiochemie Dresden/Kreischa (Prof. RK. Müller, Dr. D. Thieme), Institut für Physiologie (Prof. HHD. Meyer und Kollegen), WADA Accredited Laboratory, Warschau (Dr. D. Kwiatkowska), Hormonzentrum München (Dr. Silke Michna)